Репродукции в клетках вируса 100. Ретровирусы. Введенные в организм вакцинные штаммы должны вызывать не заболевание, а особое, качественно новое состояние - так называемый вакцинальный процесс
1. Микроорганизмы. Типы микроорганизмов. Классификация микроорганизмов. Прионы.
2. Вирусы. Вирион. Морфология вирусов. Размеры вирусов. Нуклеиновые кислоты вирусов.
3. Капсид вируса. Функции капсида вирусов. Капсомеры. Нуклеокапсид вирусов. Спиральная симметрия нуклеокапсида. Кубическая симметрия капсида.
4. Суперкапсид вируса. Одетые вирусы. Голые вирусы. Матричные белки (М-белки) вирусов. Репродукция вирусов.
5. Взаимодействие вируса с клеткой. Характер взаимодействия вирус-клетка. Продуктивное взаимодействие. Вирогения. Интерференция вирусов.
7. Проникновение вируса в клетку. Виропексис. Раздевание вируса. Теневая фаза (фаза эклипса) репродукции вирусов. Образование вирусных частиц.
8. Транскрипция вируса в клетке. Трансляция вирусов.
9. Репликация вируса в клетке. Сборка вирусов. Высвобождение дочерних вирионов из клетки.
По характеру взаимодействия генома вируса с геномом клетки выделяют автономное (геном вируса не интегрирован в геном клетки) и интеграционное (геном вируса интегрирован в геном клетки) инфицирование . Особую форму составляют латентное и персистирующее инфицирование .
Латентное инфицирование клеток вирусам . ДНК некоторых вирусов (герпесвирусы, ретровирусы) может находиться в клетке вне хромосом, либо вирусная ДНК интегрируется в ядерный геном, но вирусспецифические синтезы не происходят. Такая вирусная ДНК образует латентный провирус, реплицирующийся вместе с хромосомой. Подобные состояния вирусной ДНК нестабильны, возможны периодические реактивации с переходом в продуктивное взаимодействие «вирус-клетка», либо клетка трансформируется, давая начало злокачественному росту.
Персистирующее инфицирование клеток вирусам . Некоторые РНК-вирусы могут вызывать персистиру-ющие инфекции, проявляющиеся образованием дочерних популяций возбудителя после завершения острой фазы болезни. При этом происходит постепенное выделение вирусных частиц, но инфицированная клетка не лизируется. Нередко дочерние популяции вирионов дефектны (часто наблюдают у лиц с иммунодефицитами). Иногда такие хронические поражения протекают без клинических проявлений. В частности, вирус гепатита В способен вызывать персистирующее поражение гепатоцитов с развитием хронического гепатита; в дальнейшем возможна малигнизация клеток.
Репродуктивный цикл вирусов
Изображённые на рис. 2-3 этапы репродукции (от адсорбции вирионов до высвобождения дочерней популяции) происходят при продуктивном взаимодействии вируса с клеткой.
Рис. 2-3. Основные этапы репродукции вирусов
.
Адсорбция вириона к клетке
Первая стадия репродуктивного цикла - адсорбция вириона на поверхности инфицируемой клетки. Адсорбция происходит путём взаимодействия вириона со специфическими клеточными рецепторами. За распознавание рецепторов ответственны белки, входящие в состав капсида либо суперкапсида. Таким образом, понятие «тропизм вирусов» объясняется специфическим взаимодействием вирусных белков с поверхностными рецепторами инфицируемой клетки. Например, полиовирус проникает в клетки центральной нервной системы (ЦНС) и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и размножается в них, так как у человека и приматов только эти клетки имеют рецепторы к белкам полиовирусов,
Процесс адсорбции не зависит от температуры (то есть не требует энергетических затрат) и протекает в две фазы; фаза ионного притяжения обусловлена неспецифическим взаимодействием, фаза прикрепления происходит благодаря структурной гомологии либо комплемен-тарности взаимодействующих молекул.
Количество инфекционных вирусных частиц, адсорбированных па клетке, определяет термин «множественность заражений » (инфицирования). Обычно животная клетка содержит около 50 000 рецепторов, и её заражение носит множественный характер, то есть на клетке может сорбироваться большое количество вирионов. Тем не менее инфицированная вирусом клетка обычно толерантна к повторному заражению гомологичным вирусом.
Типы взаимодействия вируса с клеткой. Фазы репродукции вирусов.
Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой :
Продуктивный тип - завершается образованием нового поколения вирионов и гибелью (лизисом) зараженных клеток (цитолитическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма).
Абортивный тип - не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов.
Интегративный тип, или вирогения - характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация).
Репродукция вирусов:
1.адсорбция вируса на клетке- прикрепления вирусов к поверхности клетки. Вирус адсорбируется на определенных участках клеточной мембраны - так называемых рецепторах.;
2. проникновение вируса в клетку -два способа: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорбции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транспортироваться в любом направлении в разные участки цитоплазмы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки;
3.«раздевание» вируса - удалении защитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. Конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нуклеиновая кислота вируса.;
3.биосинтез вирусных компонентов в клетке - Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства.
Реализация генетической информации вируса осуществляется в соответствии с процессами транскрипции, трансляции и репликации;
4. формирование вирусов - Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру:
1. Формирование вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм;
2. Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа);
3. Формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки;
4. Сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы);
5. выход вирусов из клетки- Первый тип - взрывной - характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип - почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки.
Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом - формированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размножением - самовоспроизведением, приводящим к увеличению количества бактериальных клеток в популяции.
Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные - путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.
Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной нитью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра - нуклеоида.
Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элонгация, или рост цепи, и терминация.
Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а культуру - периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура - непрерывной.
При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов :
1. лаг-фаза;
2. фаза логарифмического роста;
3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации
бактерий;
4. фаза гибели бактерий.
Лаг-фаза - период между посевом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4-5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов.
Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом интенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5- 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.
Затем наступает фаза стационарного роста , при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.
Завершает процесс роста бактерий фаза гибели , характеризующаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжительность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интенсивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.
Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.
Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают её. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в органических растворителях. И, наконец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.
Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пигменты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины являются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают антимикробным, антибиотикоподобным действием.
Оглавление темы "Вирусология. Репродукция вирусов. Генетика вирусов.":1. Вирусология. История вирусологии. Шамберлан. Ру. Пастер. Ивановский.
2. Репродукция вирусов. Репродукция +РНК-вирусов. Пикорнавирусы. Репродукция пикорнавирусов.
3. Тогавирусы. Репродукция тогавирусов. Ретровирусы. Репродукция ретровирусов.
5. Репродукция ДНК-вирусов. Репликативный цикл ДНК-содержащих вирусов. Репродукция паповавирусов. Репродукция аденовирусов.
6. Репродукция герпесвирусов. Репликативный цикл герпесвирусов. Поксвирусы. Репродукция поксвирусов.
7. Репродукция вируса гепатита В. Репликативный цикл вируса гепатита В.
8. Генетика вирусов. Характеристика вирусных популяций. Генофонд вирусных популяций.
9. Мутации вирусов. Спонтанные мутации вирусов. Индуцированные мутации вирусов. Проявление мутаций вирусов в фенотипе.
10. Генетические взаимодействия между вирусами. Рекомбинации и перераспределение генов вирусами. Обмен фрагментами генома вирусами. Антигенный шифт.
-РНК-вирусы проникают в клетку путём слияния (парамиксовирусы) либо виропексиса (рабдо- и ортомиксовирусы). Для эффективной репродукции вирусная -РНК должна быть преобразована в +РНК - аналог клеточной мРНК (рис. 5-3).
Рис. 5-3. Репродуктивный цикл -РНК-содержащих вирусов . Проникновение вируса в клетку происходит после его адсорбции и слияния с клеточной оболочкой (1). После высвобождения вирусной -РНК происходит синтез +РНК на матрице -РНК, катализируемый РНК-зависимой РНК-пол имеразой, входящей в состав вириона (2), что приводит к образованию полных и коротких нитей. Короткие +РНК-нити участвуют в синтезе ферментов и белков для дочерних популяций (3). Среди последних особую значимость имеют белок М (4) и гликопротеины оболочки, встраивающиеся в клеточную стенку на этапах, предшествующих отпочковыванию. Полная цепь +РНК служит матрицей для синтеза молекул -РНК дочерних популяций (5). Вирионы дочерних популяций собираются на участках клеточной мембраны, модифицированных белком М (6), и высвобождаются почкованием, захватывая её фрагмент, служащий в дальнейшем суперкапсидом (7).-РНК-вирусы. Репродукция -РНК-вирусов
Ранняя стадия репродукции . После высвобождения генома вирусная транскриптаза (РНК зависимая РНК-полимераза) запускает синтез +РНК. При этом «шаблоном» для вирусной транскриптазы служит вирусный рибонуклеопротеин (то есть РНК и внутренние белки) В результате образуются полные и короткие молекулы-копии +РНК.
Поздняя стадия репродукции . Полные плюс-нити служат матрицами для синтеза молекул -РНК, составляющих геномы дочерней популяции. Короткие плюс-нити участвуют в синтезе ферментов и белков. Вирусные белки (гемагглютинин и нейраминидаза) взаимодействуют участками клеточной мембраны. Там же сорбируются и вирусные М-белки (белки матрикса) Они проявляют выраженную гидрофобность за счёт содержания до 75% нейтральных аминокислот. Это свойство даёт им способность взаимодействовать с белками и липидами клеточные мембраны и быть посредником сборки вирусных частиц. С одной стороны, М-белок распознает участки включения гликопротеинов вируса в мембрану, с другой - его специфически распознает нуклеокапсид и связывается с ним. Сборка дочерних популяций завершается после присоединения нуклеокапсида к клеточной мембране. Их высвобождение происходит путём почкования через модифицированные участки мембраны. Отпочковывающиеся вирусные частицы захватывают её фрагменты, служащие в дальнейшем суперкапсидами.
Репродукция вирусов с двухнитевыми РНК
Двухнитевые РНК-вирусы представлены семейством Reoviridae (рео- и ротавирусы). Они не имеют суперкапсида и организованы по типу кубической симметрии. С вирусной РНК связана РНК-зависимая РНК-полимераза. Вирусы отличает удлинённый репродуктивный цикл и тенденция к накоплению продуктов вирусспецифического синтеза внутри клеток. После высвобождения генома в цитоплазме клеток РНК-полимераза осуществляет синтез молекул мРНК (+РНК на одной нити -РНК. В результате образуется до 11 функциональных молекул мРНК, соответствуюших по размерам 11 сегментам одной нити -РНК. Молекулы транслируются в 11 первичных полипептидных продуктов. Их последующее расщепление приводит к образованию в заражённых клетках до 16 вторичных полипептидов. Семь первичных и два вторичных полипептида входят в состав вирусных частиц, остальные первичные и вторичные полипептиды выполняют каталитические и регуляторные функции. Параллельно, синтезированная в ходе трансляции вирусная РНК-полимераза запускает синтез минус-нитей на матрице +РНК с последующим их соединением в двухнитевую молекулу РНК. Выход образовавшихся вирионов сопровождается гибелью клетки.
Таксономия, классификация
ПАРАМИКСОВИРУСЫ
Парамиксовирусы (семейство Paramyxoviridae от лат. para - около, myxa - слизь ) - семейство РНК-содержащих вирусов. Семейство содержит респираторно-синтициальный вирус, вирусы кори, паротита, парагриппа, передающиеся респираторным механизмом. В семейство Paramyxoviridae в соответствии с общепринятой классификацией вирусов до последнего времени входили три рода: Paramyxovirus, Morbillivirus, Pneumovirus. Но недавно в классификацию внесены изменения.
Семейство Paramyxoviridae разделено на два подсемейства, увеличено количество родов:
1. Подсемейство Paramyxovirinae включает роды Respirovirus (прежнее название - Paramyxovirus), Morbillivirus и Rubulavirus (новый род);
2. Подсемейство Pneumovirinae содержит роды Pneumovirus и Metapneumovirus.
2. Морфология, размеры, особенности генома
Строение вириона. Все представители семейства Paramyxoviridae имеют сходное строение. Это сложный РНК-геномный вирус крупных размеров. Типовым представителем является вирус Сендай (он патогенен для мышей), и ультраструктура парамиксовирусов рассматривается на этом примере (рис.5). Вирион имеет округлую форму, его диаметр 150-300 нм. Снаружи находится липопротеиновый суперкапсид с множеством шипиков двух типов на поверхности (рис.4). Изнутри к суперкапсиду прилегает слой матриксного М-белка. В центральной части вириона находится тяж нуклеокапсида (РНП) со спиральным типом симметрии, свернутый в рыхлый клубок.
Рис. 4 Схема парамиксовируса Рис. 5 Электоронограмма вируса Сендай
Геном представлен крупной молекулой линейной однонитчатой минус-РНК, кодирующей 7 белков. Среди них основной капсидный белок NP, белки полимеразного комплекса L и Р, неструктурный С белок (все они входят в состав нуклеокапсида), а также М-белок и поверхностные гликопротеины. Это прикрепительные белки и белок слияния (F-белок). Прикрепительные белки образуют шипики одного типа, а F-белок - шипики другого типа. У разных парамиксовирусов прикрепительные белки представлены: HN (гемагглютинин-нейраминидаза), Н (гемагглютинин) или G-белком.
Парагрипп. По антигенам вирусных белков HN, NP, F различают 4 основных серотипа вирусов парагриппа. Типы 1, 2, 3 перекрестно реагируют с антителами к вирусу паротита. Вирус 4 типа отличается и имеет 2 подтипа (таким образом, предпологается наличие 5 типов вирусов парагриппа). Все вирусы парагриппа имеют HN - белок и поэтому проявляют гемагглютинирующую и нейраминидазную активность. Вирус парагриппа 1, 2 типа агглютинирует эритроциты кур, вирус парагриппа 3 агглютинирует только эритроциты морских свинок.
Парамиксовирус (рис. 5) связывается гликопротеинами (HN, H, или G) оболочки с поверхностью клетки (1). F-белок обеспечивает слияние оболочки вируса с плазматической мембраной клетки, без образования эндосом. Репликация генома сходна с репликацией минус РНК-геномных вирусов: РНК-полимераза вносится в клетку с нуклеокапсидом вируса. Геном транскрибируется в отдельные иРНК (2) для каждого белка и полноценную плюс-матрицу (3) для геномной РНК. Новые геномы взаимодействуют с L-, P- и NP-белками, образуя нуклеокапсиды. Синтезированный матриксный белок перемещается к внутреннему слою мембраны клетки. Предшественники гликопротеиновых шипов оболочки синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума (ЭР). Они гликозилируются, перемещаясь через ЭР и аппарат Гольджи (АГ), встраиваясь в мембрану клетки. Нуклеокапсид связывается с матриксным белком и гликопротеинмодифицированной мембраной (суперкапсидом). Вирионы выходят из клетки (4)почкованием.
Рис. 5 Репродукция парамиксовирусов
Парамиксовирусы обладают способностью с помощью F-белка переходить в соседние клетки, вызывая их слияние. При этом образуются многоядерные гигантские клетки - синцитии (симпласты). Такой механизм позволяет вирусам распространяться непосредственно из клетки в клетку, избегая действия вируснейтрализующих антител. Способность к симпластооброзаванию - характерный признак парамиксовирусов.
Репродукция вирусов (от англ, reproduce . воспроизводить) осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга:
· адсорбция вируса на клетке;
· проникновение вируса в клетку;
· «раздевание» вируса;
· биосинтез вирусных компонентов в клетке;
· формирование вирусов;
· выход вирусов из клетки
Адсорбция.
Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е.
прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбируется на определенных участках клеточной мембраны, так называемых, рецепторах.
Клеточные рецепторы могут иметь разную химическую природу, представляя собой белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды. Число специфических рецепторов на поверхности одной клетки колеблется от 104 до 105. Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц.
Поверхностные структуры вируса, «узнающие» специфические клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками. Обычно эту функцию выполняет один из поверхностных белков капсида или суперкапсида. Способность вирусов избирательно поражать определенные клетки органов и тканей организма называют тропизмом вирусов (от греч. tropos . направление).
Проникновение в клетку .
Существует два способа проникновения вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорбции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транспортироваться в любом направлении в разные участки цитоплазмы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.
«Раздевание» вируса
Процесс «раздевания» заключается в удалении защитных вирусных оболочек и
освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, в определенных участках цитоплазмы или ядра клетки, для чего клетка использует набор специальных ферментов. В случае проникновения вируса путем слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной процесс проникновения вируса в клетку сочетается с первым этапом его «раздевания». Конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нуклеиновая кислота вируса.
Биосинтез компонентов вируса .
Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства. Реализация генетической информации вируса осуществляется в соответствии с хорошо известными из биологии процессами транскрипции (от лат.transcriptio . переписывание, т.е. синтез информационных РНК, комплементарных матричным ДНК или РНК), трансляции (от лат. translatio . передача, т. е. синтез белков на рибосомах клетки с участием иРНК) и репликации (от лат. replicatio . повторение, т. е. синтез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному). Поскольку генетический аппарат вирусов остаточно разнообразен, то передача наследственной информации в отношении синтеза иРНК различна. Основные схемы реализации вирусной генетической информации могут быть представлены следующим образом:
Для синтеза иРНК одни вирусы используют клеточные ферменты, другие - собственный набор ферментов (полимераз).
Вирусная нуклеиновая кислота кодирует синтез двух классов белков: неструктурных белков-ферментов, которые обслуживают процесс репродукции вирусов на разных его этапах, и структурных белков, которые войдут в состав вирусных частиц потомства. Синтез компонентов вируса (белков и нуклеиновых кислот) разобщен во времени и пространстве, т. е. протекает в разных структурах ядра и цитоплазмы клетки. Вот почему этот уникальный способ размножения вирусов называется дисъюнктивным (от лат. disjunctus - разобщенный).
Формирование (сборка) вирусов .
Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфически узнавать друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, ионных и водородных связей.
Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру:
· формирование вирусов является многоступенчатым процессом і с образованием промежуточных форм;
· сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа);
· формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки;
· сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы).
Выход вирусов из клетки.
Различают два основных типа выхода вирусного потомства из клетки. Первый тип. взрывной. характеризуется одновременным выходом большого
количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип - почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При таком механизме клетка может продолжительное время продуцировать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции.
Время, необходимое для осуществления полного цикла репродукции вирусов, варьирует от 5-6 ч (вирусы гриппа, натуральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, аденовирусы и др.).
Образовавшиеся вирусы способны инфицировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репродукции.
Питательные Среды. Требования, предъявляемые к питательным средам. Типы питательных сред.
Питательные среды должны содержать в достаточном количестве источники углерода, азота, неорганические соли, в ряде случаев - ростовые факторы (витамины, аминокислоты), быть влажными, чтобы процесс простой диффузии проходил без затруднения, прозрачными (по возможности), чтобы визуально или под микроскопом можно было наблюдать рост микробов, стерильными, иметь оптимальные концентрации водородных ионов (рН среды) и окислительно-восстановительный потенциал. Источником азота для микроорганизмов являются белки, но большинство микробов неспособны усваивать нативный белок, поэтому используются продукты кислотного и ферментного расщепления белка: пептон, казеин.
Исходными компонентами искусственной питательной среды является мясная вода, кислотный и ферментный гидролизат казеина, свернутой крови. К основе добавляют хлорид натрия, пептон
Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины. Для получения мясной воды нежирное мясо, очищенное от сухожилий, измельчают на мясорубке, заливают двойным объемом воды, кипятят на огне, фильтруют, доливают водопроводной воды до первоначального объема, разливают по бутылкам истерилизуют.
Казеин пищевой кислотный содержит полноценный набор аминокислот, характеризуется высокой питательностью, является отходом молочной промышленности. Из казеина готовят перевар.
Пептон – продукт неполного переваривания белка, содержит альбумозы, пептоны и полипептиды аминокислот в незначительном количестве, состав их зависит от глубины расщепления белка. Пептон представляет собой порошок светло-желтого цвета, хорошо растворяется в воде, не свертывается при нагревании. Используется как источник азота и углерода.
При приготовлении сред все компоненты смешивают воде, греют или кипятят для растворения агар-агара, прозрачность придают путем фильтрования через ватно-марлевые или тканевые фильтры или осветляют добавлением куриного белка или свежей сыворотки крови, устанавливают рН среды с помощью индикаторов колориметрическим или электрометрическим способом и стерилизуют.
Классификация питательных сред
Питательные Транспортные Консервирующие
Естественные Искусственные
Синтетические
Простые Специальные Дифференциально- Элективные (Селективные)
диагностические
Плотные Жидкие
Естественные среды представляют собой природные субстраты (молоко, кровь, желчь, сыворотка, картофель). Искусственные содержат смесь природных органических веществ и продуктов их кислотного или ферментативного распада. Синтетические среды состоят из буферной солевой основы и растворов аминокислот, углеводов, пуринов, пиримидинов, нуклеотидов, нуклеозидов, жирных кислот, витаминов в точно установленных дозировках. В качестве источников азота в них используются аминокислоты. Достоинство этих сред в том, что они имеют постоянный состав, по ним можно определить потребности микробов в тех или иных питательных веществах.
Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар – продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Для иммунологических и бактериологических полей используется вымороженный, осветленный агар, который при кипячении или автоклавировании смеси порошка с водой расплавляется при температуре 85-100°С, а при охлаждении до 45-48°С образует гель.
Для приготовления, плотных питательных сред агар-агар добавляют в концентрации от 1,5 до 3%.
Простые среды.
Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред. Существует несколько способов приготовления МПБ:
а) на мясной воде с добавлением готового пептона – это так называемый мясопептонный бульон;
б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина – бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена).
Мясо-пептонный агар (МПА) – получают путей добавления к МПБ arap-arapa (l,5-3%). Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона – это скошенный агар. Для его получения пробирки для застывания среды оставляют в наклонном положении. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде пластинки – пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.
Специальные питательные среды – среды, на которых создаются условия для выращивания тех бактерий, которые не растут на простых средах. Кровяной агар или кровяной бульон – получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки. Среда применяется для выделения пневмококков, менингококков. Желчный бульон или желчный агар получают путем добавления к питательной среде медицинской желчи без консерванта, или свежеполученной от крупного рогатого скота. Среда применяется для выделения брюшнотифозных, паратифозных и дизентерийных палочек. Специальные среды для культивирования анаэробных бактерий: среда Китта-Тароцци состоит из питательного бульона, глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода.
Желатин – животный белок, продукт частичного гидролиза коллагена. Имеет вид бесцветных или светло-желтых пластинок без запаха и вкуса. В холодной воде набухает, сильно поглощая воду. При температуре 30°С растворяется, при охлаждении до 20-22°С превращается в гель (студень). Используется в микробиологии для изучения протеолитических ферментов.
Дифференциально-диагностические среды позволяют различить один вид микроба от другого. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на разной биохимической активности бактерий. В состав дифференциально-диагностических сред входит основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, определенный химический субстрат, различное отношение к которому является диагностическим признаком, индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о разложении субстрата и образовании кислых продуктов.
Агар Эндо – плотная среда, применяется для выделения и первичной идентификации энтеробактерий. В состав ее входят, кроме питательной основы, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом и фосфатом натрия. Правильно приготовленная среда бесцветна или имеет слегка розовый оттенок. Колонии бактерий (кишечная палочка), ферментирующие лактозу, окрашиваются на ней в красный цвет; бактерии, не ферментирующие лактозу (сальмонеллы), остаются бесцветными.
Среда Левина (лактозоэозинметиленовый агар) – среда для выделения энтеробактерий. Колонии лактозоферментирующих бактерий окрашены в темно-синий или черный цвет, колонии лактозоотрицательных бактерий вырастают под цвет среды (светло-фиолетового цвета).
Среды Гисса – набор определенных углеводов для изучения ферментативной активности бактерий и их дифференциации по этим признакам.
Элективные питательные среды содержат дополнительные вещества, задерживающие рост грамположительных бактерий. Селективные питательные среды стимулируют рост одних микробов и угнетают рост других. Селективные условия получают путем добавления в среду химических веществ. Так как в этих средах патогенные бактерии размножаются и накапливаются, их называют также средами обогащения.
Среда Плоскирева – плотная питательная среда, содержащая соли желчных кислот, бриллиантовый зеленый, лактозу и индикатор. Эта среда является не только селективной, так как подавляет рост многих микробов и способствует лучшему росту возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерии, но и дифференциально-диагностической, так как лактозоотрицательные бактерии (шигеллы) образуют на ней бесцветные колонии, а лактозоположительные – кирпично-красные.
Селенитовая среда - является лучшей средой обогащена для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрии, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.
Среда Мюллера служит для накопления сальмонелл. К питательной среде добавлют мел, раствор Люголя и гипосульфит натрия. При взаимодействии этих веществ образуется тетратионат натрия, который угнетает рост кишечных палочек, но создает благоприятные условия для размножения сальмонелл.
Висмут-сульфит агар (среда Вильсона-Блера) – содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний чернота цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.
Желточно-солевой агар (ЖСА) –среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».
Теллуритовые среды (сывороточно-теллуритовый агар, кровяно-теллуритовый агар) – селективные среды для выделения дифтерийных бактерий, содержат теллурит калия. Бесцветная соль теллура, содержащаяся в питательной среде, восстанавливается дифтерийными бактериями до металла, окрашивающего колонии в черный цвет.
Щелочной агар элективен для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.
Консервирующие среды – среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Консервирующие среды применяются когда нет возможности быстрого посева на питательные среды. Для бактерий наиболее употребительны консерванты:
а) глицериновая смесь, состоящая из 0,5 л химически чистого
глицерина и 1,0 л физиологического раствора.
б) боратная смесь
в) фосфатно-буферная смесь
Для длительного сохранения свежевыделенных и производственных культур применяют полужидкий голодный агар, в этой среде при пониженной жизнедеятельности микробов продукты обмена накапливаются незначительно, что способствует хорошему сохранению культур.
Специальные среды.
В бактериологии широко применяются сухие питательные среды промышленного производства, которые представляют собой гигроскопические порошки, содержащие все компоненты среды, кроме воды. Для их приготовления используются триптические перевары дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин). Они удобны при транспортировке, могут длительно храниться, избавляют лаборатории от громадного процесса приготовления сред, приближают к разрешению вопроса о стандартизации сред. Медицинская промышленность производит сухие среды Эндо, Левина, Плоскирева, висмутсульфит агар, питательный агар, углеводы с индикатором ВР и другие.
Термостаты
Для культивирования микроорганизмов используют термостаты.
Термостат – это аппарат, в котором поддерживают постоянную температуру. Прибор состоит из нагревателя, камеры, двойных стенок, между которыми циркулирует воздух или вода. Температура регулируется терморегулятором. Оптимальная температура для размножения большинства микроорганизмов 37°С.
11. Условия успешной антибиотикотерапии. Отрицательные стороны антибиотикотерапии. Действие антибиотиков на микробы в зависимости от дозы препарата. Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам.
Рациональная антибиотикотерапия
Врач всегда должен помнить, что назначать антибиотики следует только при инфекциях бактериальной этиологии. Выбор антибиотиков должен основываться на знании их природной активности в отношении предполагаемых или установленных возбудителей заболевания, а также на локальных и региональных данных о резистентности микроорганизмов. Следует назначать только препараты с доказанной клинической эффективностью при инфекциях данной локализации, обращая при этом внимание на форму выпуска, профиль безопасности, возможность межлекарственных взаимодействий и др.
Обеспечить высокую эффективность лечения может только своевременное начало антибактериальной терапии. Не менее важными являются адекватное дозирование, оптимальная длительность курса антибактериальной терапии и своевременная оценка эффективности стартового антибиотика (через 48-72 ч от начала лечения). Существенную роль играет и оптимальное соотношение стоимость/эффективность. При выборе препарата и проведении антибактериальной терапии обязательно учитываются особенности пациента (возраст, масса тела, физиологические состояния (беременность, период лактации), иммунодефицитные состояния, сопутствующие заболевания, поведенческие стереотипы и др.) и течение заболевания (локализация, клинические проявления, тяжесть и др.).
Отрицательные стороны антибиотикотерапии
- Дисбактериоз: антибиотики убивают полезную и патогенную микрофлору. Выраженность дисбактериоза зависит от дозы, продолжительности, типа лекарства и возраста человека. Как правило, после основной болезни маленьким детям приходится восстанавливать микрофлору. Как этого избежать? Параллельно с антибиотиками (2–3 раза в день) и 2 недели после лечения пить пробиотики (эубиотики) – бактерии для микрофлоры кишечника. Тогда дисбактериоза не будет либо его проявления уменьшатся.
- Опасно пить женщинам в первом триместре беременности. Но если имеется болезнь, угрожающая жизни матери и ребенку, врач выбирает наименьшее зло. Не рекомендуется принимать кормящим грудью женщинам.
- Индивидуальная непереносимость, аллергия или побочные эффекты. Об этом необходимо уведомить врача перед назначением антибиотика или после назначения, если побочные явления появились впервые, и врач сменит лекарство.
Важное условие рациональной антибиотикотерапии - правильный выбор препарата и назначение достаточных доз, способных оказать пагубное действие на
микроорганизм. Назначение препарата в малых дозах может способствовать развитию резистентности микробов.
Определение чувствительности к антибиотикам
А) методом дисков.
На поверхность питательного агара засевают газоном испытуемую культуру (стафилококк, кишечная палочка). Чашки приоткрывают и подсушивают при комнатной температуре 10-15 минут. Затем накладывают диски пинцетом на расстоянии 2 см друг от друга и от краев чашки. Чашки помещают в термостат для инкубации на 18-20 часов, перевернутыми кверху дном, после чего учитывают результат. Чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность, учет проводят в отраженном свете. С помощью линейки и измерителя определяют диаметр зон задержки роста вокруг дисков, включая диаметр дисков. Оценку результатов проводят по таблицам, которые содержат пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных микроорганизмов.
Б) методом серийных разведении.
Этот метод является количественным, так как позволяет определить минимальную ингибирующую концентрацию, т.е. наименьшую концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры. Исследование начинают с приготовления основного раствора, из которого готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10 6 -10 7 бактериальных клеток в 1 мл. Для контроля используют посев культуры на бульон без антибиотика. Посевы инкубируют при 37°С 18-20 часов. В контроле появится рост (пробирка станет мутной). Пробирки с прозрачной питательной средой указывают на задержку роста испытуемой культуры, а последняя пробирка с прозрачной питательной средой содержит наименьшую ингибирующую дозу антибиотика, определяющую степень чувствительности испытуемой культуры к антибиотику.
